Подробное описание
Научные группы и чем они занимаются
«Разработка универсальной диагностической платформы на основе технологий CRISPR-Cas для выявления инфекционных заболеваний различной природы»
На сегодняшний день одним из основных вызовов человечеству является появление новых штаммов вирусов и бактерий. Для предотвращения распространения инфекций важно быстро и точно диагностировать их на ранних стадиях заболевания. Большинство используемых на сегодняшний день методов диагностики дороги, требуют наличия специализированного оборудования, а также сравнительно длительного времени для получения результатов диагностики.
Разрабатываемая в НИК "НаноБио" диагностическая платформа, основанная на реакции изотермической амплификации (RPA) и коллатеральной активности системы CRISPR-Cas, имеет чувствительность, сравнимую с ПЦР-РВ (103 копий), при этом относительно короткое время реакции (30-40 минут) и не требует дополнительного лабораторного оборудования, так как весь процесс тестирования проходит при фиксированной температуре (37-39°C). Это открывает широкие перспективы для её использования вне лаборатории без потери в точности диагностики.
«Изучение новых CRISPR-Cas систем и их применение в биотехнологии»
Наша группа занимается поиском и исследованием новых CRISPR-Cas систем, открывая их в самых различных источниках. Мы работаем с тщательно изученными геномами и метагеномами из обширных баз данных, а также с уникальными образцами, которые нам предоставляют наши коллабораторы. Сначала с помощью компьютерного анализа (in silico) мы выделяем потенциальные CRISPR-Cas кандидаты. Как только подходящая система обнаружена, мы переходим к лабораторным испытаниям in vitro – проверяем, способен ли выбранный кандидат направленно разрезать предложенные нами фрагменты ДНК. Если система показывает активность, мы продолжаем работу двумя путями, в зависимости от целей. В первом случае мы тестируем систему in vivo, проверяя ее активность в культурах клеток человека. Это позволяет определить ее эффективность и потенциальное применение для редактирования генома. Во втором случае мы адаптируем CRISPR-Cas систему для использования в диагностике – она становится основой метода, который помогает быстро и точно определять наличие конкретных патогенов (бактерий и вирусов) в исследуемых образцах.
Наша цель – не просто изучение новых CRISPR-Cas систем, а их перевод в активное использование в исследовательских и практических приложениях.
«Изучение молекулярных механизмов систем рестрикции-модификации и других защитных систем бактерий от вирусов на уровне одиночных бактериальных клеток»
Одними из самых распространённых защитных систем бактерий являются системы рестрикции-модификации. Такие системы действуют за счёт активности эндонуклеазы рестрикции, которая вносит двунитевой разрыв в специфические сайты узнавания на ДНК и метилтрансферазной активности, которая метилирует геном бактерии, защищая его от деградации эндонуклеазой рестрикции. Несмотря на высокий уровень защиты, обеспечиваемый этими системами, в некоторых случаях ДНК инфицирующего бактериофага избегает деградации и подвергается модификации. В результате возникает модифицированное вирусное потомство, полностью устойчивое к действию системы рестрикции-модификации.
Мы изучаем влияние вариации экспрессии генов систем рестрикции-модификации на эффективность защиты одиночных бактерий от вируса. Также мы занимаемся изучением механизмов работы других систем защиты бактерий от вируса на уровне одиночных бактерий.
«Изучение комплексов SMC и белков деления бактерий»
Цитоскелет – это белковый «каркас» клетки. Долгое время белки цитоскелета считались принадлежностью лишь эукариотических клеток – действительно, зачем бактериям цитоскелет, если они покрыты жесткой клеточной стенкой? Тем не менее, за последние 30 лет у бактерий были обнаружены гомологи всех основных белков цитоскелета эукариот – актина, тубулина и промежуточных филаментов. Эти белки в бактериях принимают участие в различных жизненно важных процессах, в том числе в поддержании формы клетки, сегрегации молекул ДНК, клеточном делении. Одним из важнейших белков бактериального цитоскелета является FtsZ – ключевой белок деления, являющийся гомологом тубулина. Наша группа занимается изучением свойств белка FtsZ: мы визуализируем структуры, которые формирует этот белок в бактериальных клетках и в пробирке; определяем, с какими белками он взаимодействует; выясняем, чем отличаются роли и функции белка FtsZ в разных видах бактерий. Кроме того, мы имеем цель выяснить, как делятся бактерии, которые не имеют белка FtsZ. Наконец, нам интересны белки бактерий, которые формируют цитоскелет-подобные структуры.
Белковые комплексы типа SMC (от англ. Structural maintenance of chromosomes, далее в тексте - комплексы SMC) являются ключевыми участниками пространственной организации ДНК во всех живых организмах - в бактериях, археях и эукариотах. В бактериях имеется несколько гомологов комплексов SMC, которые выполняют, на первый взгляд, несвязанные друг с другом функции, однако действуют, по-видимому, посредством очень похожих между собой, консервативных механизмов. Наша группа проводит комплексное исследование нескольких видов бактериальных комплексов типа SMC.
«Исследование развития инфекции клеток гигантскими бактериофагами»
Нашим основным объектом исследования является гигантский бактериофаг phiKZ и родственные ему фаги. За 60 минут, которые проходят с момента впрыска фаговой ДНК phiKZ до выхода новосинтезированных фаговых частиц, кардинально перестраиваютcя все процессы внутри клетки и существенно меняют морфологию бактерии: бактериальный нуклеоид меняет свое положение, уступая центральное место сферическому компартменту, напоминающий ядро эукариотической клетки. Данный компартмент покрыт белковой оболочкой, внутрь которой упаковывается фаговая ДНК и часть белков, участвующих в транскрипции и репликации, кроме того он удерживается в центре клетки за счет тубулин-подобных фаговых белков. Для транскрипции своего генома фаг phiKZ исключительно свои ДНК-зависимые РНК-полимеразы, которых у него две.
Наша группа изучает процессы, происходящие внутри клетки на фоне инфекции фагом phiKZ и механизмы, отвечающие за их осуществление.
«Одномолекулярные исследования ДНК-белковых взаимодействий»
Группа фокусируется на исследованиях ДНК-белковых взаимодействий при помощи метода оптического захвата, реализованного на установке Лазерный пинцет. Комбинация метода оптического захвата с микрофлюидной системой ламинарных потоков позволяет отслеживать изменения механических свойств индивидуальных молекул ДНК в ходе взаимодействия с ДНК-связывающими белками. При помощи метода оптического захвата наша группа изучает свойства нуклеопротеиновых комплексов, формируемых бактериальным белком RecA (E. coli, D. radiodurans) на дуплексной и однонитевой (одноцепочечной) молекулах ДНК. В бактериях RecA в виде нуклеопротеинового филамента, формируемого на однонитевой ДНК, участвует сразу в нескольких ключевых процессах: репарации тяжелых повреждений ДНК, передаче генов устойчивости к антибиотикам, запуске SOS-ответа. Считается известным, что в зависимости от типа связанного нуклеотидного кофактора филамент RecA на однонитевой ДНК может находиться в активной или неактивной конформации. Для поддержания активной конформации филамента необходимо наличие в среде свободной АТФ. АТФазная активность RecA потенциально приводит к локальному возникновению участков неактивной конформации в структуре филамента, в целом обладающего активной конформацией. Нашей группой проводятся исследования конформационных перестроек и состояний филамента RecA а также регуляции активности RecA белковыми кофакторами.
Группа также занимается исследованиями бактериальной транскрипции и её регуляции на уровне одиночных молекул в режиме реального времени, применяя метод акустической силовой спектроскопии. Мы являемся первыми в мире, кто успешно применил этот одномолекулярный подход для изучения процессов транскрипции. Разработанная методика позволила выявить характер ингибирования новых лассо-пептидов ацинетодина и клебсидина. На данный момент мы подготавливаем публикацию, в которой представлен уникальный способ синергетического ингибирования РНК-полимеразы антибиотиком стрептолидигином совместно с транскрипционными факторами GreA и GreB. Наши исследования в этой области не только расширяют понимание молекулярных механизмов бактериальной транскрипции, но также могут иметь важные практические применения в разработке новых антимикробных препаратов
«Исследование белка RecN - SMC-подобного компонента бактериального SOS-ответ»
RecN является одним из факторов SOS-ответа - процесса, возникающего в бактериальной клетке в ответ на повреждение ДНК. Причиной таких повреждений, в частности, может быть облучение излучением УФ-диапазона или воздействие различного рода антибактериальных агентов. Результатом активации SOS-ответа может являться точное восстановление поврежденных участков ДНК, а также адаптация бактерии к повреждающему воздействию, за счет повышенного мутагенеза в клетках бактерий. Важно отметить, что за счет этого SOS-ответ представляет собой основной механизм адаптации бактерий к действию антибиотиков.
Белок RecN экспрессируется и действует на ранней стадии SOS-ответа, и согласно данным, полученным in vivo, является одним из ключевых факторов успешного протекания данного процесса. Установлено, что RecN относится к SMC-белкам (Structural Maintenance of Chromosomes) - семейству АТФаз, принимающих участие в динамическом регулировании организации структуры хромосом. SMC-белки обладают высокой консервативностью как среди прокариот, так и эукариот.
«Кинетика сверхбыстрых процессов в молекулах и кластерах»
Для исследования быстро протекающих процессов используются импульсы света фемтосекундной длительности. Такие импульсы создаются с помощью фемтосекундного лазера на титан-сапфире. Лазерные импульсы (800нм) преобразуются с помощью генератора гармоник (400 и 266 нм) и генератора белого света (излучение суперконтинуума 400-1000 нм). Измерения проводятся методом «возбуждение-зондирование» с помощью линии оптической задержки. Первый импульс приводит к возбуждению объекта, второй импульс приходит к объекту с задержкой и используется для анализа состояния в котором находится объект. Изменяя задержку можно получить информацию о процессах происходящих в исследуемом объекте.
В нашей группе проводятся исследования быстропротекающих процессов в люминесцентных зондах и кластерах инертных газов. Отметим, что при использовании лазерных фемтосекундных импульсов легко наблюдаются различные нелинейные оптические процессы, в частности многофотонное поглощение.
Парк оборудования
- ЯМР спектрометр Varian DirectDrive NMR System 700 Mhz
- Масс-спектрометр с ионно-циклотронным резонансом с Фурье преобразованием FTMS и двумя ионными источниками ионизации: электроспрей и МАЛДИ (FT-ICR MS 9.4 Tesla, Varian, США)
- Хромато-масс-спектрометр LCMS–IT–TOF (Shimadzu, Япония)
- Масс спектрометр AB Sciex 5800 MALDI TOF-TOF
- Комплекс исследования динамики нанобиомашин FA-1 (установка на базе исследовательского микроскопа Carl Zeiss Axio Imager Z1)
- Фемтосекундная лазерная система RAPOP-100 (АВЕСТА, Россия)
- Микроскоп медико-биологический Nikon Ti с цифровой камерой
- Планшетный спектрофотометр CLARIOstar BMG LABTECH GmbH
- Комплексной установки для исследования динамики нанобиомашин
- Комплекс оптико-электронных приборов для физико-химического анализа биологических образцов
- Высокопроизводительная центрифуга для разделения биологических образцов Avanti J-30i Beckman Coulter
- Комплекс электромеханических приборов для разделения неоднородной смеси на составные части различной плотности биологических образцов
- Амплификатор для ПЦР в реальном времени CFX96 TouchRealTime System (Bio Rad)
А также оборудование для работ по экспрессии белков, биохимических и молекулярно-биологических исследований, водоподготовки методами дистилляции и мембранной фильтрации, биохимических и молекулярно-биологических исследований, термостатирования и создания вакуумных условий для подготовки и исследования биологических образцов.
Статьи
- Organization and Role of Bacterial SMC, MukBEF, MksBEF, Wadjet, and RecN Complexes. Morozova, N.E., Potysyeva, A.S. & Vedyaykin, A.D. Cell Tiss. Biol. 18, 115–127 (2024)
- Анализ белка Cas1_3 асгардархей: экспериментальная характеристика потенциального промежуточного звена в эволюции CRISPR-Cas систем. М.В. Абрамова, А.С. Малых, М.А. Казалов, Я.М. Гатиева, П.А. Селькова, А.П. Якимова, А.А. Васильева, А.Н. Арсениев, М.А. Ходорковский. Научно-технические ведомости СПбГПУ. Физико-математические науки, 2024, принята в печать
- Dependence of post-segregational killing mediated by Type II restriction–modification systems on the lifetime of restriction endonuclease effective activity. Kozlova S, Morozova N, Ispolatov Y, Severinov K. mBio 0:e01408-24
- tRNA anticodon cleavage by target-activated CRISPR-Cas13a effector. Ishita Jain; Matvey Kolesnik; Konstantin Kuznedelov; Leonid Minakhin; Natalia Morozova; Anna Shiriaeva; Alexandr Kirillov; Sofia Medvedeva; Alexei Livenskyi; Laura Kazieva; Kira Makarova; Evgene Koonin; Sergei Borukhov; Konstantin Severinov; Ekaterina Semenova. Sci. Adv.10,eadl0164(2024)
- Features of the DNA Escherichia coli RecN interaction revealed by fluorescence microscopy and single-molecule methods. Viktoria D. Roshektaeva, Aleksandr A. Alekseev, Alexey D. Vedyaykin, Viktor A. Vinnik, Dmitrii M. Baitin, Irina V. Bakhlanova, Georgii E. Pobegalov, Mikhail A. Khodorkovskii, Natalia E. Morozova. Biochemical and Biophysical Research Communications, Volume 716, 2024, 150009
Гранты
1) «Локализация белков RecN и RecA в клетке в процессе SOS-ответа»
Руководитель: Наталия Морозова
Грант РНФ
Срок выполнения: 2024-2026
2) «Конформационные состояния рекомбиназы RAD51»
Руководитель: Александр Алексеев
Грант РНФ
Срок выполнения: 2024-2026
3) «Выяснение молекулярных механизмов действия бактериальных SMC-подобных комплексов»
Руководитель: Алексей Ведяйкин
Грант РНФ
Срок выполнения: 2024-2027
4) «Поиск мембранных везикул вирусного происхождения у гигантского бактериофага, не образующего фаговое ядро»
Руководитель: Дарья Антонова
Грант РНФ
Срок выполнения: 2025-2026
5) «Изучение молекулярно-генетических механизмов возникновения и анализ последствий неврологических осложнений острых респираторных вирусных инфекций»
Руководитель: Андрей Владимирович Васин
Государственное задание
Срок выполнения: 2024-2026
